Lo scopo del progetto è quello di isolare e caratterizzare le cellule staminali della congiuntiva e identificare le condizioni favorevoli per la realizzazione in vitro di lembi di epitelio congiuntivale per trapianto. Molti pazienti soffrono di alterazioni del tessuto congiuntivale o disordini ad esso collegati (traumi, rimozioni chirurgiche in seguito a tumore, etc.). Inoltre numerose condizioni patologiche possono alterare la funzionalità della congiuntiva, ma anche determinare la degenerazione e la perdita irreversibile del tessuto, producendo un danno permanente della superficie oculare.
Dei possibili risultati del progetto potrebbero quindi beneficiare pazienti affetti da forme di occhio secco molto gravi associate alla progressiva degenerazione del tessuto congiuntivale, oppure associate a gravi malattie sistemiche che producono anche un’aggressione ai tessuti dell’occhio.
«Il successo di questo studio - dicono i ricercatori di Fondazione Banca degli Occhi del Veneto - aprirebbe la possibilità concreta di un rapido trasferimento di questo nuovo approccio di terapia cellulare direttamente al paziente».
Abbiamo intervistato la dottoressa Marina Bertolin, responsabile del progetto di ricerca.
Dottoressa Bertolin, vuole spiegarci in cosa consiste e quali scopi si prefigge il progetto di ricerca che sta portando avanti presso la Fondazione Banca degli Occhi del Veneto orientato alla creazione di una congiuntiva in vitro?
Ogni anno più di mille pazienti in Italia e più di 100.000 nel mondo sviluppano gravi alterazioni della superficie oculare, e del tessuto congiuntivale in particolare, a causa di traumi chimici o fisici, e patologie quali pterigio, secchezza oculare, sindrome di Stevens-Johnson, pemfigoide oculare cicatriziale, sindrome di Sjogren e altre malattie autoimmuni. Tali alterazioni provocano spesso la degenerazione irreversibile e/o perdita del tessuto congiuntivale, con sintomi che possono includere dolore cronico, fastidio oculare, riduzione o compromissione dell’acuità visiva, riduzione dei movimenti oculari.
Le terapie convenzionali generalmente adottate per la cura delle gravi alterazioni della superficie oculare (farmaci anti-infiammatori, lacrime artificiali, trapianto autologo o allogenico di tessuto) risultano spesso poco efficaci.
Nel corso degli ultimi tre decenni la terapia cellulare ha dimostrato di essere un potenziale e talvolta prezioso strumento terapeutico. Tuttavia non esistono ad oggi terapie cellulari per rigenerare e ricostruire l’epitelio congiuntivale.
Il team di ricercatori di Fondazione Banca degli Occhi del Veneto si avvale dell’expertise e di strutture ideali per la realizzazione di questo ambizioso progetto. Fin dal 2003, la FBOV distribuisce lembi di cellule staminali corneali per pazienti affetti da Limbal Stem Cell Deficiency e, dal 2003 a oggi, tale prodotto è stato innestato in più di 200 pazienti. Forti di questa esperienza, nel 2014 la Fondazione ha avviato questo studio con l’obiettivo di aprire la strada al primo studio clinico basato sull’innesto di lembi di epitelio congiuntivale derivante da cellule congiuntivali autologhe, così da fornire una nuova opzione terapeutica per pazienti con gravi alterazioni della congiuntiva. Lo studio si sta sviluppando in 4 principali direzioni: l’identificazione di marcatori cellulari specifici, la selezione del prelievo bioptico ottimale dal quale rigenerare l’epitelio sano da innestare, l’ottimizzazione delle condizioni di coltura delle cellule e l’identificazione di uno scaffold appropriato.
Uno degli obiettivi del progetto è quello di caratterizzare nuovi marcatori molecolari che permettano l’identificazione univoca del fenotipo delle cellule epiteliali della congiuntiva. Citocheratine e mucine rappresentano da sempre in letteratura dei buoni candidati, tuttavia la loro specificità è dibattuta. Inoltre in molti casi di superficie oculare patologica, coesistono deficit di cellule caliciformi che portano ad un falso negativo nell’indagine. La ricerca di un marcatore congiuntivale specifico e affidabile risulta pertanto una necessità stringente per un’appropriata caratterizzazione dell’identità delle cellule manipolate. A tal fine è in corso uno screening molecolare di trascritti specificatamente espressi nelle colture congiuntivali che si spera possa portare ad individuare molecole più specifiche da utilizzare in saggi molecolari, cellulari e biochimici.
Quali sono gli aspetti di maggiore complessità che sta incontrando nel corso di tale attività di ricerca?
Ebbene, bisogna sottolineare quanto sia scarsa la conoscenza relativa alla distribuzione delle cellule staminali dell’epitelio congiuntivale sulla superficie bulbare e i fornici. Saggi molecolari, biochimici e cellulari sono stati pertanto eseguiti su molteplici campioni in aree differenti della superficie congiuntivale al fine di approfondire tali conoscenze. Gli esperimenti effettuati hanno permesso di definire meglio quale sia il sito ottimale per il prelievo di un campione bioptico da usare come starting material per la realizzazione dei graft congiuntivali e pertanto caratterizzato da una maggiore percentuale di cellule con capacità auto-rigenerativa (staminali congiuntivali).
Oltre alla mappatura delle cellule staminali della superficie congiuntivale, risulta interessante anche riuscire a definire come siano distribuite le cellule caliciformi mucipare, essenziali per contribuire ad una corretta lubrificazione oculare. La strategia ideale sarebbe quella di ingegnerizzare epiteli congiuntivali maturi che siano cioè in grado di generare cellule mucipare già nella fase in vitro oppure, se ciò non fosse possibile, che siano in grado di generare tali cellule una volta innestati. Alcuni clinici suggeriscono tuttavia che anche il solo trapianto di cellule dell’epitelio congiuntivale, senza cellule mucipare, potrebbe essere sufficiente, se integrato con l’uso di lacrime artificiali, per supplire alla mancanza delle secrezioni mucose.
Nella pianificazione di un nuovo prodotto per terapie avanzate a base di cellule staminali diventa cruciale individuare protocolli animal-free. Le linee guida europee ed italiane per la terapia cellulare prevedono infatti che i prodotti per terapie avanzate siano generati all’interno di Cell Factories autorizzate ed operanti secondo le norme Good Manufacturing Practice. Suggeriscono inoltre di adottare una progressiva eliminazione dei reagenti di origine animale (per esempio, sieri bovini) e di componenti xenogeniche (come per esempio le cellule 3T3 murine usate come feeder-layer), allo scopo di ridurre il rischio di zoonosi. Ad oggi, tuttavia, non sono disponibili validi protocolli alternativi, e i protocolli standard che includono componenti di origine animali risultano ancora i più efficaci per il mantenimento delle caratteristiche di staminalità delle colture epiteliali. Inoltre, evidenze sperimentali dimostrano che spesso variazioni dei mezzi di coltura possono influenzare la capacità di adesione delle cellule al substrato su cui sono state seminate, compromettendo così la crescita della cultura stessa. I nostri studi sembrano ad oggi aver individuato un protocollo completamente animal-free efficace per la cultura di cellule congiuntivali su membrana amniotica e su gel di fibrina.
Altro punto cruciale della nostra ricerca è stato quello di individuare uno scaffold ideale per la crescita dei lembi di epitelio congiuntivale. La membrana amniotica e il gel di fibrina sono da sempre modelli standard di scaffold per la realizzazione di epiteli limbo-corneali e congiuntivali. Esistono tuttavia dei forti limiti all’applicazione chirurgica di graft di cellule congiuntivali cresciute su gel di fibrina a causa della forma irregolare della superficie congiuntivale e, legato ad esso, al difficile ancoraggio del gel di fibrina. Per tale motivo la membrana amniotica risulta ad oggi il miglior scaffold per questo tipo di applicazione. Rimangono ancora numerosi limiti legati al suo utilizzo. Si tratta infatti di un tessuto eterogeneo, difficile da manipolare sia durante la fase tecnica di realizzazione del lembo in laboratorio che durante l’utilizzo in sala operatoria. Il progetto che stiamo portando avanti ha permesso di trovare risposte a molti di questi quesiti con l’individuazione di un appropriato protocollo di preparazione della membrana amniotica in grado di ridurne la variabilità d’origine e l’individuazione di supporti in grado di facilitare il trasferimento del graft di cellule epiteliali congiuntivali sul paziente. Al fine di ovviare in maniera definitiva a tali problematiche, una fase successiva dello studio investigherà scaffold differenti rispetto alla membrana amniotica (derivanti da Fish Scale o a base di gelatina e/o collagene umano).
L’esperienza accumulata nel corso degli anni con il trapianto di cellule staminali limbo-corneali e l’interazione con clinici e chirurghi esperti nel trattamento delle patologie congiuntivali sta facilitando il trasferimento di quello che fino a qualche anno fa era un interessante progetto di ricerca ad una fase clinica che potrebbe iniziare già nel corso del 2018.
