Crocine, cianidine e cumarina nel trattamento delle patologie retiniche

Riassunto

Lo stress ossidativo generato durante i processi infiammatori può essere considerato un meccanismo comune alla base di molte malattie degenerative della retina. È noto che l'uso di integratori orali contenenti zafferano ha effetti benefici nelle malattie oculari, anche se non se ne conoscono i meccanismi a livello molecolare. Lo scopo di questo studio è caratterizzare i meccanismi attraverso i quali lo zafferano può esercitare effetti protettivi contro i danni ossidativi nelle cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) e se la sua associazione con sambuco e meliloto può avere proprietà benefiche significativamente superiori. Le cellule ARPE-19 sono state pretrattate con zafferano, o con una mix composta da zafferano, sambuco e meliloto ed esposte a perossido di idrogeno per 3 ore. Dopodiché abbiamo valutato la vitalità cellulare, lo stress ossidativo e lo stato infiammatorio. I risultati mostrano che sia lo zafferano da solo che la mix sono in grado di contrastare gli effetti dannosi del perossido di idrogeno, ma la mix risulta più efficace nel prevenire l’infiammazione. Pertanto, l’assunzione di integratori alimentari che contengano i composti presenti nella mix può rappresentare una strategia utile nel trattamento delle malattie degenerative della retina.

La retina è uno dei tessuti con il più alto tasso di consumo di ossigeno, il che implica anche una maggiore suscettibilità allo stress ossidativo, che generalmente è causato dallo squilibrio tra la produzione di specie reattive e la capacità di eliminarle (1, 2). Questa condizione viene ulteriormente peggiorata dall'ambiente infiammatorio generato dall'attivazione delle cellule retiniche residenti o dall'infiltrazione di cellule infiammatorie (3). La conseguente secrezione di alcune citochine pro-infiammatorie, come MCP-1, interleuchina (IL)-1β e IL-18, attiva diversi segnali intracellulari che, a loro volta, stimolano la produzione di altre citochine, che possono reclutare altre cellule infiammatorie, generando così un circolo vizioso che aumenta l'infiammazione ed espone le cellule retiniche ai danni ossidativi. Pertanto, sebbene diversi fattori possano contribuire alle malattie degli occhi, lo stress ossidativo generato durante i processi infiammatori può essere considerato un meccanismo comune alla base di molte malattie degenerative della retina.

Come già accaduto in altre patologie, lo stile di vita può influenzare la prevenzione e la cura di molte malattie degli occhi, come la retinopatia diabetica (DR), la degenerazione maculare senile (AMD) e la cataratta. Recentemente, Rondanelli et al. hanno proposto una piramide alimentare che propone cosa si dovrebbe consumare ogni giorno, evidenziando la necessità di inserire nella dieta le spezie (zafferano e curcumina) circa 3-4 volte/settimana (4). Numerosi trials clinici hanno evidenziato che l'uso di composti naturali in preparazioni topiche e come integratori alimentari può avere un effetto benefico nel controllare i sintomi e prevenire o rallentare la progressione delle patologie retiniche (5-7). Ad esempio, è stato dimostrato che l'uso di integratori orali contenenti zafferano ha effetti benefici nelle malattie oculari, come DR, AMD, retinite pigmentosa e glaucoma (8, 9). Spesso negli integratori commerciali si cerca di migliorare l'efficacia di un singolo farmaco erboristico mediante la combinazione con altri composti naturali. Uno degli ultimi integratori entrati in commercio, Visuretin (Visufarma), associa allo zafferano altri composti antiossidanti come sambuco e meliloto, contenenti rispettivamente cianidina e cumarima.

Questo studio mira a caratterizzare i meccanismi attraverso i quali lo zafferano può esercitare effetti protettivi contro i danni ossidativi nelle cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) e se la sua associazione con sambuco e meliloto ha proprietà benefiche significativamente superiori.

MATERIALI E METODI

Le cellule ARPE-19, una linea cellulare di epitelio retinico pigmentato, sono state coltivate in DMEM/F12 (1:1) contenente il 10% di siero bovino fetale inattivato e 2 mM di L-glutammina, 100 U/ml di penicillina e 100 µg/ml di streptomicina a 37°C in 5% di CO2. Negli esperimenti, le cellule ARPE-19 sono state coltivate in terreno standard per 3 giorni, poi il terreno di coltura è stato sostituito con terreno contenente zafferano (>3% crocina) (SAF) e una miscela di zafferano, sambuco (13% antocianina) e meliloto (12% cumarina) (1:5:5) (MIX). Dopo 24 ore, al terreno di coltura è stato aggiunto perossido di idrogeno per altre 3 ore, dopodiché le cellule sono state utilizzate per valutare la vitalità cellulare, lo stress ossidativo e lo stato infiammatorio.

Le cellule vitali sono state determinate utilizzando il Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay secondo le istruzioni del produttore. I livelli delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono stati valutati utilizzando un kit di analisi delle specie reattive dell'ossigeno, attenendosi al protocollo del produttore. La luminescenza è stata quantificata utilizzando un luminometro. Per determinare il glutatione ossidato (GSSG) è stato eseguito il test GSH/GSSG-Glo™ secondo le istruzioni del produttore. In breve, il test si basa sulla conversione catalizzata dalla glutatione S-transferasi (GST) di un derivato della luciferina in luciferina in presenza di glutatione. La luminescenza è stata quantificata utilizzando un luminometro. Per valutare lo stato infiammatorio è stata valutata l'attività della caspasi-1, che è considerata un marcatore dell’infiammazione, utilizzando il test Caspase-Glo® 1 Inflammasome Assay.

L’analisi statistica è stata eseguita con il software GraphPad Prism 4.0. Il valore p <0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

RISULTATI

Lo zafferano e la mix proteggono la vitalità dell'RPE dallo stress ossidativo

Il perossido di idrogeno (OX) ha ridotto significativamente la proliferazione delle cellule ARPE-19. L'aggiunta di zafferano (SAF), così come MIX, ha migliorato significativamente la vitalità cellulare quando le cellule sono esposte a OX (figura 1).

Lo zafferano e la mix riducono lo stress ossidativo

Uno squilibrio tra la generazione di ROS reattivi e i sistemi di difesa antiossidanti rappresenta la causa principale della disfunzione cellulare. L'esposizione delle cellule ARPE-19 a OX ha aumentato significativamente la produzione intracellulare di ROS rispetto alle cellule incubate con mezzo di controllo (figura 2). Il pretrattamento con SAF e MIX ha ridotto significativamente la produzione di ROS indotta da OX. La quantità di ROS prodotti è stata rapportata al numero di cellule presenti nel campione analizzato.

Il glutatione (GSH) è un antiossidante abbondante in grado di prevenire i danni causati dai ROS mantenendo l'equilibrio redox. In presenza di stress ossidativo, il GSH viene ossidato e forma un dimero collegato da un legame disolfuro (GSSG). Come mostrato nella figura 3, l'esposizione delle cellule ARPE-19 a OX ha aumentato significativamente l’ossidazione di GSH. L'aggiunta di SAF e MIX ha contrastato la formazione di GSSG quando le cellule sono state esposte a OX.

Lo zafferano e la mix diminuiscono l'attività della caspasi-1

La caspasi-1 è un enzima che viene attivato dopo l'assemblaggio del complesso dell'inflammasoma ed è quindi considerato un marcatore di infiammazione. Come mostrato nella figura 4, OX aumenta significativamente l'attività della caspasi-1 nelle cellule ARPE-19. Il trattamento con SAF non influenza l'attività di casp-1, ma ripristina l'incremento dovuto all'esposizione a OX al livello delle cellule non trattate. Sia l'attività costitutiva della caspasi-1, che quella indotta da OX, sono state ridotte significativamente dall’aggiunta di MIX al terreno di coltura.

CONCLUSIONI

I risultati suggeriscono che l’integrazione della dieta con un’associazione composta da zafferano, sambuco e meliloto, aiutando le cellule dell’RPE a contrastare lo stress ossidativo e lo stato infiammatorio, possa rappresentare una strategia utile a potenziare il trattamento delle malattie degenerative della retina.

Gli autori dichiarano l’assenza di conflitti di interesse.