Analisi morfo-funzionale delle ghiandole di Meibomio e correlazione con livelli plasmatici ormonali in pazienti affetti da DM II

La MGD (meibomian gland disease) è la causa più comune della sindrome dell’occhio secco evaporativo (1). Esiste una connessione nota tra MGD e fattori sistemici, come la carenza di androgeni (2), l'iperlipidemia (3) e il diabete mellito (DM) (4). È stato recentemente evidenziato che il DM è un fattore di rischio significativo per lo sviluppo della MGD (5). Lo scopo dello studio è stato quello di identificare parametri clinici e biomarcatori utili a migliorare il follow-up e il trattamento dei pazienti con DM, affetti da MGD. 

Materiali e metodi

Questo studio di tipo cross-sectional ha incluso pazienti con DM di tipo II e sintomi di MGD del reparto di Oculistica dell'Ospedale A. Fiorini di Terracina (Latina), da ottobre 2022 a marzo 2023. Lo studio è stato condotto in conformità con i principi della Dichiarazione di Helsinki e della Conferenza internazionale sull'armonizzazione e le raccomandazioni per la buona pratica clinica. Il consenso informato è stato acquisito da tutti i soggetti prima dell'inizio dello studio. Il criterio di inclusione prevedeva pazienti affetti da DM di tipo II con sintomi di MGD. I criteri di esclusione includevano:

• Infezioni oculari recenti;
• Allergie stagionali;
• Qualsiasi storia di chirurgia oculare;
• Uso di farmaci o colliri che compromettevano l’integrità della superficie oculare;
• Storia di uso di lenti a contatto;
• Stato di gravidanza secondo autodichiarazione;
• Malattie della tiroide;
• Malattie autoimmuni;
• Uso di contraccettivi orali;
• Fumo;
• Terapia ormonale antiandrogenica;
• Terapia ormonale sostitutiva in corso di menopausa. 

A tutti i soggetti è stato richiesto di completare l'ocular surface disease index (OSDI) (Allergan, Inc., Irvine, CA, Stati Uniti) (6). È stato eseguito l'esame biomicroscopico del segmento anteriore e studiato il margine palpebrale per la presenza di teleangectasie, irregolarità, orifizi ghiandolari occlusi e modificazione in senso antero/posteriore della giunzione mucocutanea. Quest'ultimo parametro è stato valutato secondo i criteri di Yamaguchi et al. (7) riportati nella tabella 1. La superficie oculare è stata colorata con fluorescina per valutare il break-up time (TFBUT) e verde di lissamina per determinare il punteggio secondo Van Bijsterveld (vBS) (8).  La produzione lacrimale è stata valutata con il test di Schirmer I e II (9). La meibografia è stata eseguita per ciascun paziente utilizzando il topografo Sirius® (CSO, Costruzione Strumenti Oftalmici, Firenze, Italia) (10). Sono state registrate tre immagini per ciascun occhio. Il dispositivo determina l'area di perdita ghiandolare in percentuale in modo semi-automatico e valuta il meiboscore come segue: grado 0, nessuna perdita; grado 1, ≤25%; grado 2, 26–50%; grado 3, 51–75%; grado 4, >75% (figura 1).

Analisi delle immagini

Sono state selezionate tre acquisizioni per ogni occhio per analizzare la lunghezza, larghezza e l’area delle MGs. Due sperimentatori hanno eseguito l'analisi delle immagini della meibografia utilizzando il software ImageJ e il plug-in NeuronJ. 

Nella figura 2 viene riportato il processo di selezione semi-automatica delle MGs, mediante un tracciamento poligonale delle strutture ghiandolari visualizzabili sulle immagini della meibografia. Le aree poligonali corrispondenti alle strutture ghiandolari venivano poi isolate ricavandone l’area. La larghezza ghiandolare è stata calcolata in alto, al centro e sul fondo di ciascuna MG, poi divisa per la dimensione del frame di acquisizione e convertita in mm/mm2.  Grazie al plug-in NeuronJ, invece, è stato possibile misurare la lunghezza ghiandolare (fig. 3).

La lunghezza della MG è pari alla lunghezza della ghiandola stessa diviso la dimensione del frame di acquisizione, poi trasformata in un rapporto in mm/mm2. La lunghezza media delle MGs è stata calcolata sommando le lunghezze delle singole ghiandole e dividendo per il numero totale delle MGs; lo stesso procedimento è stato eseguito per le larghezze delle MGs e per l’area. Nella figura 4 è riportata l’elaborazione con ImageJ di un’immagine acquisita con topografo Sirius® (CSO, Costruzione Strumenti Oftalmici, Firenze, Italia). È stato raccolto un campione di sangue al mattino e a digiuno per analizzare i livelli di glucosio, emoglobina glicata (HbA1c), trigliceridi, colesterolo totale, colesterolo HDL (lipoproteine ad alta densità), LDL (lipoproteine a bassa densità), diidroepiandrosterone solfato (DHEA-S), androstenedione (ASD), cortisolo, testosterone, estradiolo e progesterone. L'analisi statistica è stata realizzata utilizzando la versione 22 di SPSS (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) e un p-value inferiore a 0,05 è stato considerato significativo

Risultati

Centoventitré pazienti con DM di tipo II e con sintomi di MGD sono stati arruolati nel reparto di oculistica dell'Ospedale A. Fiorini di Terracina (Latina). Di questi, 69 pazienti avevano una storia recente di intervento di cataratta, 4 avevano malattia della tiroide, 22 erano forti fumatori, 3 erano in terapia antiandrogenica e 7 erano in menopausa con terapia ormonale sostitutiva; pertanto, 18 pazienti di sesso femminile (14,6%) hanno soddisfatto i criteri di inclusione e sono stati effettivamente inclusi nello studio. I dati demografici e i segni clinici dei pazienti studiati sono riassunti nella tabella 2. 

Tutti i pazienti erano in terapia orale con metformina. Il 70% dei pazienti presentava un test di Schirmer I < 10 mm/5 min e il 94,1% dei pazienti aveva un test di Schirmer II < 10 mm/5 min, mentre il 47,1% dei pazienti aveva un valore inferiore a 4 mm/5 min. Il TFBUT è stato inferiore a 5 s nel 94,4% pazienti. Il valore mediano del punteggio della ML era 3, mentre il vBs era 2. Il punteggio OSDI era superiore a 20 nel 53,1% con un valore medio di 28,5. Il 56% dei pazienti è stato classificato normopeso in base al percentile BMI e il 44% era in sovrappeso.

Biomarcatori sanguigni

I valori medi della glicemia rilevati sono stati di 124,56 ± 16,65 mg/dl (min 88 max 152), Hb1Ac del 6,5% ± 0,69 (min 5,7%, max 8,3%). Il 75% dei pazienti aveva un valore di Hb1Ac ≤ 6,5%. I livelli medi dei trigliceridi erano di 145,5 ± 67,9 mg/dL (min 70 max 319); il colesterolo totale medio era 165 ± 32,59 mg/dL (min 117 max 245); il valore medio dell'HDL era 45,5 ± 9,15 mg/dL (min 32 max 60); l'LDL medio era 90,3 ± 20,3 mg/dL (min 54 max 129); il livello medio di testosterone era 1,0 ± 1,7 nmol/L (min 0,13 max 5,14); il valore medio di DHEA-S era 122,37 ± 110,52 µg/dL (min 40,5 max 343); il valore medio di ASD era 1,6 ± 0,93 ng/dL (minimo 0,35 massimo 3,29); il valore medio di cortisolo era 11,54 ± 3,46 µg/dL (min 6,8 max 17,9); i valori di estradiolo erano 28.6 ± 15.4 pg/ml (min 5.7 - max 81.3); i valori di progesterone medi erano di 0,47 ng/ml (min 0,12 – max 5,3). ll DHEA-S ha mostrato una correlazione negativa con l'età (r = −0,88; p = 0,02) e con il vBS (r = −0,78; p = 0,02). Il cortisolo e ASD hanno rivelato una correlazione positiva con la lunghezza delle MGs (r = 0,51; p = 0,04 e r = 0,75; p = 0,02) (fig. 5).

I trigliceridi hanno invece rivelato una correlazione negativa con la lunghezza delle MGs (r = −0,51; p = 0,02) (fig. 6). Per gli altri parametri analizzati non è stata trovata alcuna correlazione significativa.

Analisi della meibografia

In ciascuna palpebra studiata sono state identificate una media di 17,12 ± 2,83 MGs (min 13 – max 18). La lunghezza media totale delle MGs era 1023,94 ± 213,07 mm/mm2 (min 653 – max 1384). Le lunghezze delle MGs presentavano un'associazione negativa con la perdita dell'area delle MGs (r = −0,51; p = 0,02). La media della larghezza delle MGs è stata 75,88 ± 15,53 mm/mm2 ed era negativamente correlata al test di Schirmer II e TFBUT (r = −0,5; p = 0,02; r = −0,56; p = 0,01). L'area delle MGs è stata 172,69 ± 31,29 mm2, anch’essa correlata negativamente al test di Schirmer II (r = −0,49; p = 0,04). 

Il 50% dei pazienti aveva un meiboscore pari a 2 (perdita del 26-50% di MGs) e il restante 50% un meiboscore pari a 1 (perdita ≤25%). Sia il meiboscore che la perdita dell'area delle MGs hanno presentato una associazione positiva all'età (r = 0,55; p = 0,01 e r = 0,47; p = 0,04). C’è stata una differenza statisticamente significativa tra la perdita dell'area delle MGs e i gruppi di età, determinata dal metodo unidirezionale ANOVA (F = 5,61, p = 0,015). Un test post hoc di Tukey ha rivelato che esisteva una differenza statisticamente significativa tra il gruppo più anziano e i pazienti di età inferiore a 60 anni (p = 0,01) e il gruppo di pazienti tra 61 e 79 anni (p = 0,04). Tuttavia, non sono state riscontrate differenze significative tra i gruppi di età inferiore a 60 anni e i pazienti tra i 61-79 anni (p = 0,75). La perdita media dell’area delle MGs è stata del 26,29 ± 11,62% (min 5–max 47). La perdita dell’area delle MGs è stata più alta nel gruppo più anziano (≥80 anni; quattro pazienti, con valore medio di 39,8 ± 6,61%) in confronto con il gruppo di pazienti di età compresa tra 61 e 79 anni (sette pazienti, con valore medio di 24,23 ± 11,87%) e ≤ 60 anni (sette pazienti, con valore medio di 20,64 ± 7,47%) (fig. 7). C'è stato un elevato accordo tra gli osservatori nel calcolo della lunghezza, larghezza, area e meiboscore delle MGs (coefficiente di correlazione intraclasse (ICC), rispettivamente, di 0,98; 0,88, 0,96 e 0,94). L'analisi di regressione utilizzando un metodo di selezione a coppie ha identificato che l'età ha mostrato un impatto significativo sulla perdita dell'area delle MGs (F = 5,4; p = 0,02). C'era una differenza del 19,1% tra la media della perdita di area delle MGs dei pazienti di età superiore a 80 anni e quella dei pazienti di età inferiore a 60 anni. La differenza si è rivelata statisticamente significativa (IC 95% 4,2-34,1; p = 0,01). Allo stesso modo, la differenza del 15,5% tra la perdita dell’area delle MGs dei pazienti di età compresa tra 61 e 79 anni e quella dei pazienti di età superiore a 80 anni è risultata statisticamente significativa (IC95% 0,67–30,45; p = 0,04). Al contrario, non è stato identificato nessun valore statisticamente significativo per tutte le altre variabili analizzate. 

Discussione

Lo scopo di questo studio era quello di identificare eventuali biomarcatori sierici nei pazienti affetti da DM II e MGD. Il cortisolo e l’ASD sono risultati associati all’aumento della tortuosità delle MGs mentre un livello elevato di trigliceridi era associato a una riduzione della lunghezza delle MGs. Inoltre, una ridotta concentrazione sierica del DHEA-S è correlata ad alterazioni negative nella colorazione della superficie oculare utilizzando il verde di lissamina (punteggio vBs). L'ampiezza della MGs è infine risultata correlata negativamente al test di Schirmer II ed al TFBUT.

Il ruolo dell’età e il diabete

Hashemi et al. (11) hanno riportato una prevalenza della MGD del 71,2% nei pazienti di età superiore a 60 anni. Inoltre, la prevalenza è gradualmente aumentata dal 64,4% nel gruppo di 60-64 anni, all’82,4% nei pazienti di età superiore a 80 anni (12). Il nostro studio ha riportato risultati simili, in quanto la perdita dell'area delle MGs era più frequente nei soggetti con più di 80 anni. In questo gruppo di pazienti, si è verificata una perdita media dell'area delle MGs pari al 40%, rispetto a una media del 20% del gruppo più giovane. L’associazione tra DM di tipo II e MGD è già stata riportata in letteratura (13-20). Tao Yu et al. (14,18) hanno mostrato che il 57,6% delle persone nel gruppo con DM aveva una perdita delle MGs, contro il 33% del gruppo di controllo. Inoltre, hanno descritto modifiche alle MGs, come l’ingrandimento delle unità acinose, forma irregolare e la riduzione della densità delle unità degli acini. Gli autori hanno teorizzato che potrebbe esserci un certo grado di occlusione duttale delle MGs nei pazienti con DM-II. L'ostruzione duttale delle MGs porta all'accumulo di meibum, provocando così la dilatazione cistica e l'alterata morfologia degli acini, fino all'atrofia degli acini con diminuzione della densità acinosa. Abbiamo evidenziato che l'ampiezza delle MGs risulta negativamente correlata al TFBUT e al test di Schirmer II. Ciò significa che la larghezza delle MGs può predire la riduzione della funzione delle MGs. Abbiamo ipotizzato inoltre che, se il corpo delle MGs accumula meibum e non è in grado di secernerlo attraverso gli orifizi, va incontro a una progressiva atrofia ghiandolare. Fan Fang et al. (15) hanno studiato la correlazione tra MGD e i livelli di HbA1c in pazienti con DM di tipo II, riferendo che l'HbA1c ≥ 7% potrebbe provocare disfunzioni delle MGs, legate in particolare allo spessore dello strato lipidico e alla perdita percentuale delle MGs. In modo simile abbiamo effettuato un'analisi dividendo i pazienti in base al loro livello di HbA1c, ma non abbiamo identificato alcuna differenza rilevante tra le variabili analizzate. Ciò potrebbe essere legato al piccolo campione arruolato, ma anche ad una popolazione di diabetici con un buon compenso glicemico ed una bassa fluttuazione dell’HbA1c. 

Il ruolo degli ormoni

Le MGs sono ghiandole sebacee e gli androgeni sono noti per regolare lo sviluppo, differenziare l'attività e la produzione dei lipidi delle ghiandole sebacee in tutto il corpo (21-24). L'attività e la secrezione delle ghiandole sebacee diminuiscono con l'età; questa disfunzione associata all'invecchiamento è stata correlata sia con l’atrofia delle cellule acinari che con una riduzione dei livelli sierici di androgeni (25). Sullivan et al. hanno dimostrato che l’invecchiamento negli uomini e nelle donne va di pari passo con l’aumento significativo di eritema delle palpebre inferiori, teleangectasie, cheratinizzazione, irregolarità dei margini posteriori, metaplasia degli orifizi e secrezioni opache (26). Inoltre, l'assunzione di farmaci anti-androgenici porta alla MGD, ad alterazione del profilo lipidico nelle secrezioni delle MGs e alla diminuzione della stabilità del film lacrimale con conseguente occhio secco evaporativo (27).  Va inoltre sottolineato come la metformina possa alterare alcuni livelli ormonali; in particolare può abbassare i livelli sierici sia di estradiolo (28) che di testosterone (29,30). Di contro l’iperinsulinemia porta a iperandrogenismo e a un deficit progestinico, come è ben noto nella sindrome dell’ovaio policistico, favorendo la produzione ovarica di androgeni (31-33). Il nostro studio è in accordo con questi risultati; il DHEA-S diminuisce con l'età, e ciò risulta associato a una modifica della colorazione della superficie oculare (vBS). L'analisi della regressione tra DHEAS ed età ha mostrato che l'età è un buon fattore predittivo per i valori di DHEAS (F = 17,9; p < 0,001), suggerendo che il 52% delle variazioni era previsto dall'età. Si ritiene che la diminuzione della produzione di DHEAS con l'età svolga un ruolo importante sugli effetti pro-infiammatori di IL-6 nell'uomo (34). In maniera dose-dipendente, le concentrazioni di DHEAS e ASD inibiscono la produzione di IL-6 da parte dalle cellule mononucleari nel sangue periferico; il fatto che i loro livelli diminuiscano notevolmente con l'età porta quindi all'aumento della produzione di IL-6 durante l’invecchiamento (34). Livelli alti di cortisolo sono associati a livelli più elevati di IL-6 e la gravità dell'infiammazione è risultata associata a un basso rapporto DHEAS/cortisolo (35). È interessante notare che abbiamo evidenziato come sia il cortisolo che l'ASD risultano positivamente associati alla lunghezza delle MGs; questo risultato potrebbe significare che questi ormoni sono biomarcatori della lunghezza delle MGs e possono avere un ruolo nel follow-up dei pazienti con MGD. Tuttavia, bisogna considerare che solo l'ASD ha mostrato un risultato significativo nell'analisi di regressione. L'ASD è un fattore predittivo significativo sulla lunghezza delle MGs (F = 4,72; p <0,045), suggerendo che il 22% della variazione è prevista da questo fattore. 

Ruolo dei livelli sierici dei lipidi e BMI

Una metanalisi sistematica ha riportato una forte correlazione positiva tra la dislipidemia e la MGD e ha suggerito di eseguire studi prospettici per dimostrare una relazione temporale con la MGD che precede la dislipidemia (36). Nel nostro studio non abbiamo identificato un’associazione perché il nostro campione di pazienti aveva un valore complessivamente normale di colesterolo totale, e solo un paziente presentava un valore superiore a 200 mg/ml; per questo motivo il campione non era rappresentativo in tal senso. È interessante notare che un livello elevato di trigliceridi era correlato a una riduzione delle lunghezze delle MGs. Butovich et al. (37) hanno descritto una nuova condizione chiamata “high triglycerides/low waxes (HTLW) syndrome”. Hanno osservato una severa diminuzione nel meibum e nelle lacrime degli esteri della cera e degli esteri del colesterolo, e un incremento da 20 fino a 30 volte superiore alla norma della frazione dei trigliceridi. La nostra osservazione sull’associazione presente tra l’alto livello di trigliceridi e la riduzione della lunghezza delle MGs è piuttosto innovativa e possiamo supporre che sia il primo cambiamento morfologico delle ghiandole di Meibomio che riflette un’alterazione nel secreto meibomiano. Crediamo che ci siano almeno due fattori che possano giustificare questi cambiamenti. Da un lato c'è un aumento della viscosità del meibum, dall’altro l’ostruzione degli orifizi ghiandolari dovuta a cheratinizzazione correlata al processo pro-infiammatorio. Questo aumento di pressione nel lume delle MGs potrebbe essere una spiegazione all'aumento della larghezza delle MGs e questo cambiamento anatomico può poi portare all’atrofia ghiandolare. Il percentile del BMI è risultato essere un fattore predittivo della tortuosità e dell’atrofia delle MGs in pazienti di età pediatrica (38) e anche un fattore di rischio di MGD nella popolazione adulta (39). Nella nostra ricerca, il BMI non è stato associato ad alcun parametro analizzato. I vari fattori patogenetici sono riassunti nella figura 8.

Conclusioni

Questo studio ha diversi limiti; il campione di popolazione che abbiamo analizzato è piccolo ed è stato ottenuto da un unico centro medico. L'incorporazione di soggetti anziani può inoltre mascherare la reale relazione presente tra le alterazioni del pannello lipidico nel sangue e la MGD. Inoltre, nel nostro campione erano incluse unicamente pazienti di sesso femminile. Nel nostro centro, i pazienti di sesso maschile che lamentano sintomi da MGD erano molto pochi, e fra questi molti di loro assumevano farmaci antiandrogenici oppure erano forti fumatori. Entrambi erano criteri di esclusione per il nostro studio. Per fornire una corretta rappresentazione della popolazione, il campione dovrebbe essere ampliato includendolo anche pazienti di sesso maschile. Tutti i dati sono stati ottenuti da una singola visita ed è stata eseguita la meibografia in un solo momento, senza studi prospettici longitudinali; per questo motivo è difficile distinguere se i cambiamenti morfologici delle MGs fossero associati allo stato di DM e/o al cambiamento nei livelli ormonali. Inoltre, l'assenza di gruppi di controllo non consente di affermare eventuali differenze tra i pazienti con MGD e quelli senza MGD. Nel complesso, questo studio fornisce un punto di partenza per ulteriori ricerche. L'identificazione dei biomarcatori clinici è estremamente utile per il trattamento di questi pazienti, in particolare in quei centri dove la meibografia non è disponibile. Cortisolo, DHEA-S, ASD e i livelli di trigliceridi hanno mostrato associazioni interessanti nella nostra popolazione diabetica.   

Gli autori dichiarano l’assenza di conflitti di interesse.